Поделиться


О выполнении ПНИЭР по проекту «Доклинические исследования лекарственного средства, действующего на нейротрофины-BDNF и/или NGF с активацией MAP киназы, для лечения последствий ишемического инсульта»


3 этап

В ходе выполнения работ по 1 этапу Госконтракта выполнен аналитический обзор информационных источников, который подтвердил актуальность выбранного направления исследований, а также новизну предлагаемых технологических подходов получения производного 4-фенилпирролидинона-2; проведены патентные исследования. В результате патентного поиска и анализа отобранных информационных источников установлен уровень техники по тематике патентных исследований и выявлены 6 (из них 5 – патенты-эквиваленты) патентных документов, релевантных тематике патентного исследования; разработаны методы контроля качества лекарственного средства на основе производного 4-фенилпирролидинона-2, такие как: высоэффективная жидкостная хроматография для количественного определения, спектроскопия ядерного магнитного резонанса для определения и подтверждения структуры вещества; произведена закладка опытных образцов лекарственного средства в количестве 24 ампулы, из 3 серий (2311171, 2511172, 2711173) на хранение для изучения стабильности в естественных условиях и проведены испытания на соответствие параметров качества ЛС требованиям на момент закладки на хранение.
В ходе выполнения работ по 2 этапу Госконтракта было проведено углубленное изучение специфической активности лекарственного средства. На модели полушарного инсульта мозга, которая создавалась методом эндоваскулярной транзиторной окклюзии средней мозговой артерии, была показана эффективность лекарственного средства на основе производного 4-фенилпирролидинона-2, в дозе 1ЭТД.
Фармакокинетические исследования лекарственного средства показали, что в интервале исследованных доз фармакокинетика «VRF_11» носит дозозависимый характер. Установлено, что экскреция «VRF_11» происходит как через почки, так и с каловыми массами.
Наработаны опытные образцы лекарственного средства для проведения доклинических исследований и проведен их контроль качества.
В результате проведенных исследований острой токсичности «VRF_11» было установлено, что при однократном внутривенном введении максимальных доз препарата «VRF_11», гибели животных не наблюдалось. LD50 для мышей и крыс не была достигнута при введении максимально возможной дозы. Не было выявлено влияния на массовые коэффициенты органов при однократном внутривенном введении белым аутбредным мышам. Не выявлено разницы по приросту массы тела между группами с введением исследуемого препарата и контрольными группами при однократном внутривенном введении белым аутбредным крысам в острых дозах. В экспериментах не установлено половых и межвидовых различий.
При изучении хронической токсичности (30 дней) не отмечалось гибели животных при внутривенном введении «VRF_11» в эквитерапевтической и превышающих эквитерапевтическую в 2 и 3 раза дозах (2 ЭТД и 3 ЭТД). Результаты изучения хронической токсичности показали, что многократное внутривенное введение исследуемого препарата кроликам не вызывало нарушений функционального состояния основных органов и систем организма. Не выявлено местно-раздражающего действия исследуемого препарата при его многократном внутривенном введении кроликам.
Результаты изучения иммунотоксичности лекарственного средства показали, что «VRF_11» в дозе 10,8 мг/кг и 108 мг/кг не вызывает активацию гуморального и клеточного звена иммунитета как у самцов, так и у самок.
Изучение аллергенности показало, что «VRF_11» не обладает аллергическими свойствами.
В результате проведенных исследований репродуктивной токсичности установлено, что внутривенное введение препарата «VRF_11» не оказывало влияния на генеративную функцию.
При изучении мутагенности доказано, что при воздействии эквитерапевтических и высоких доз препарат не обладает цитогенетической и мутагенной активностью, а также не оказывает генотоксического действия в экспериментах in vitro и in vivo.
В результате исследования препарата «VRF_11» на пирогенность, согласно XIII Государственной фармакопее Российской Федерации, ОФС.1.2.4.0005.15, было установлено, что препарат в тест-дозе 128 мг/кг апирогенен.
Исследование на пирогенность проводилось на кроликах. За 18 ч до испытания кроликов лишали корма без ограничения воды. В исследовании было использовано 10 кроликов.
На основании фармакокинетических исследований по изменению содержания препарата «VRF_11», порошок для приготовления раствора для инъекций (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) в крови и таких органах, как печень, почки, кора головного мозга показано, что в интервале исследованных доз фармакокинетика препарата носит дозозависимый характер.
В результате проведенных исследований на аутбредных мышах установлено, что при однократном внутривенном введении терапевтических доз препарата «VRF_11», порошок для приготовления раствора для инъекций (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России), наблюдалось усиление экспрессии целевых генов, что подтверждает механизм действия препарата «VRF_11» через нейротрофины – BDNF и/или NGF с активацией МАР киназы, для лечения последствий ишемического инсульта.
Проведенное масштабирование лабораторной технологии получения разрабатываемого лекарственного средства не привело к изменению основных показателей качества получаемого продукта (чистота, массовое содержание основного вещества).
Была проведена оптимизация лабораторной технологии получения ЛС с целью уменьшения расхода сырья и растворителей, снижения трудозатрат и увеличения выхода конечного продукта, а также повышения безопасности отдельных стадий.
Была проведена валидация основных процессов оптимизированной технологии получения ЛС.
В ходе выполнения работ по отчётному 3 этапу Госконтракта было проведено: изучение стабильности и сохранения физико-химических свойств ЛС, после длительного (в течение 20 месяцев) хранения при 23 ± 2 °С и методом ускоренного хранения (в течении 720 часов, что соответствует 24 месяцам). Исследования стабильности физико-химических свойств ЛС показали, что за период хранения в естественных условиях параметры качества удовлетворяли требованиям спецификации.
В рамках заключительного третьего этапа Государственного контракта проведено дополнительное патентное исследование и подана 1 заявка на изобретение: «Способ крупномасштабного синтеза калиевой соли 2-[2-(2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)ацетамидо]этансульфокислоты».
Были подготовлены документы, входящие в регистрационное досье на препарат: разработан проект протокола клинического исследования лекарственного препарата для медицинского применения, проект брошюры исследователя, проект инструкции по медицинскому применению лекарственного препарата, подготовлена патентная заявка на изобретение.


2 этап

В ходе выполнения работ по этапу №2 Государственного контракта были получены следующие результаты:

  1. Разработан план доклинических испытаний лекарственного средства для лечения последствий ишемического инсульта. В процессе работы обобщены нормативные требования к проведению доклинических исследований и использованию лабораторных животных. План включает общую информацию по доклиническим исследованиям лекарственного средства, информацию о тестируемом объекте и объектах сравнения, указана информация о тест системах, включая: вид и источник животных, условия их содержания, приведены критерии распределения животных по группам и их идентификация, описаны общие экспериментальные процедуры по оценке состояния животных, порядок и способы введения тестируемых и контрольных образцов, требования к выполнению клинических наблюдений, измерение массы тела и объема потребляемого корма, порядок обращения с умирающими животными и животными, найденными мертвыми, проведения эвтаназии и анализ данных, утверждение и изменение планов исследований, отклонения; оформления отчёты по исследованиям. Представлены разделы запланированных исследований биологической активности: Изучение специфической активности и механизмов действия лекарственного средства; Исследование фармакокинетики; Исследование острой токсичности; Исследование субхронической/хронической токсичности; Исследование местно-раздражающего действия; Исследование специфической токсичности; Исследование иммунотоксического действия; Оценка воздействия препарата на клеточный иммунитет по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ); Оценка влияния тестируемого препарата на гуморальный иммунный ответ; Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов; Оценка функциональной активности нейтрофилов; Изучение аллергизирующих свойств препарата «VRF»; Аллергизирующее действие препарата в тесте гиперчувствительности «немедленного» типа (реакция общей анафилаксии – анафилактический шок); Аллергизирующее действие препарата в кожном тесте гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах (реакция кожной анафилаксии); Исследование мутагенности; Изучение способности тестируемого препарата производить генные мутации в клетках млекопитающих в условиях in vitro; Оценка повреждающего действия тестируемого препарата на хромосомы и/или митотический аппарат эритробластов в тесте in vivo на образование микроядер в эритробластах грызунов; Исследование репродуктивной токсичности тестируемого препарата.
  2. Наработаны образцы ЛС в количестве 20 серий: 05031801-05031820, в количестве – 800 ампул, акт наработки от 07.03.2018 для проведения доклинических исследований. Проведен полный контроль качества образцов ЛС всех наработанных серий препарата для лечения последствий ишемического инсульта в соответствии с проектом разработанной ФСП на ЛС. Контроль качества опытных образцов порошка препарата для лечения последствий ишемического инсульта (VRF_11) подтвержден протоколами анализа качества №№1-20 от 05.03.2018 г.
  3. Технологический процесс ТП-2 Получение 2-(2-оксо-4-фенил-пиролидин-1-ил) уксусной кислоты в пределах установленных параметров обладает повторяемостью и приводит к ожидаемым результатам. Валидацию технологического процесса ТП-4 Получение 2-[2-(2-оксо-4-фенил-пиролидин-1-ил)-ацетамидо]-этансульфокислоты калиевой соли считать законченной, т.к. были получены положительные результаты испытаний на 3-х последовательных сериях.
  4. Проведенный второй этап испытания пирогенности подтвердил апирогенность препарата «VRF_11, порошок для приготовления раствора для инъекций (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) в тест-дозе 128 мг/кг.
  5. Изучение мутагенности позволило показать, что препарат VRF_11 порошок для приготовления раствора для внутривенного способа введения (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава, Россия) не обладает мутагенной активностью при тестировании мутаций замены пар оснований в молекуле ДНК в тесте Эймса на штаммах S. typhimurium ТА98, ТА100, ТА1537 в вариантах с метаболической активацией S9 и без таковой, не оказывает генотоксического действия на клетки костного мозга мышей C57Bl6 после введения внутрь.
  6. В результате проведенных исследований на аутбредных мышах и крысах установлено, что при однократном внутривенном введении максимальных доз препарата VRF_11, порошок для приготовления раствора для инъекций (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России), гибели животных не наблюдалось. LD50 для мышей и крыс не была достигнута при введении максимально возможной дозы 750 мг/кг по лекарственной форме, что в 17 раз больше, чем терапевтическая доза для человека 42 мг/кг. Не выявлено разницы по приросту массы тела между группами с введением исследуемого препарата и контрольными группами. В экспериментах не установлено половых и межвидовых различий. Препарат не обладает местно-раздражающим действием при однократном введении.
  7. В экспериментах по доклиническому исследованию хронической (30-ти дневной) токсичности и местнораздражающего действия при внутривенном введении VRF_11, порошок для приготовления раствора для внутривенного введения (ФГБОУ ВО РНИМУ им Н.И. Пирогова, Россия были использованы следующие тест-системы: половозрелые аутбредные половозрелые аутбредные крысы и кролики породы Шиншилла, самцы и самки. Результаты исследования хронической токсичности препарата на белых аутбредных крысах и кроликах в течение 30 дней показали, что при внутривенном введении в эквитерапевтической и превышающих эквитерапевтическую в 2 и 3 раз дозах, не наблюдалось гибели животных, а также не происходило нарушений функционального состояния основных органов и систем организма. Не выявлено местно-раздражающего действия исследуемого препарата при его многократном внутривенном введении крысам и кроликам. Не выявлено разницы по приросту массы тела между группами с введением исследуемого препарата и контрольными группами. В экспериментах не установлено половых и межвидовых различий.
  8. В экспериментах по доклиническому исследованию антиишемической активности препарата были использованы следующие тест-системы – крысы-самцы Wistar. В дозе 1 ЭТД (250 мг/кг) показал положительное влияние на поведение животных в послеоперационном периоде, статистически значимое по сравнению с контрольными животными и животными под воздействием эталонного препарата. У крыс из экспериментальной группы повышалась общая двигательная, ориентировочно-исследовательская и снижалась тревожность. Динамика стабилизации неврологического статуса у животных из группы 1 ЭТД (250 мг/кг) так же значимо выше чем у контрольных животных. Объем очага ишемии значимо снижался уже к 14 суткам под воздействием препарата VRF_11 в дозе 250мг/кг, тогда как в остальных группах значимые различия наблюдаются лишь к месяцу после моделирования ишемии.
  9. В экспериментах по исследованию иммунотоксичности были использованы следующие тест-системы – мыши гибриды первого поколения (СВАхС57BL/6)F1, самцы и самки.Установлено, что в дозе 1 ЭТД (10,8 мг/кг) и 10 ЭТД (108 мг/кг) препарат не вызывает активацию гуморального и клеточного звена иммунитета как у самцов, так и у самок. Исследования гуморального иммунного ответа показали, что изучаемый препарат в дозе 10,8 мг/кг не отличался от контрольных показателей у самцов и самок. Доза исследуемого препарата 108 мг/кг вызывала статистически значимый рост титра сывороточных антител (IgG) по сравнению с контрольной группой. Однако, отличие титра реакции от контроля как у самцов, так и самок составило менее чем в 4 раза, что свидетельствует об отсутствии влияния препарата на индукцию синтеза антител.
  10. В экспериментах по доклиническому исследованию репродуктивной токсичности в качестве тест-системы были использованы половозрелые аутбредные крысы Wistаr самцы и самки. Установлено, что в дозах 1 ЭТД (250 мг/кг) и 2 ЭТД (500 мг/кг) при внутрибрюшинном введении (аналоге внутривенного способа) беременным крысам вещество не имеет эмбриотоксических свойств, так как не влияет на динамику массы тела беременных крыс, продолжительность беременности, а также на показатели пред- и постимплантационной гибели эмбрионов, не установлено влияния на количество живых плодов, массу тела эмбрионов, их кранио-каудальный размер. Показаны данные о влиянии препарата на снижение динамики набора массы тела с 14 по 28 дни антенатального развития крысят. Препарат статистически достоверно повышал двигательную и исследовательно-ориентировочную активность крысят по сравнению с контролем. В испытанных дозах препарат не вызывал пороки развития эмбрионов, что свидетельствует об отсутствии у вещества тератогенного действия. Препарат не оказывал влияния на генеративную функцию животных.
  11. В экспериментах по доклиническому исследованию аллергенности препарата VRF_11 были использованы следующие тест-системы: морские свинки самцы и самки и мыши самцы. В результате проведенных исследований выявлено, что препарат VRF_11, порошок для приготовления раствора для внутривенного введения (ФГБОУ ВО РНИМУ им Н.И. Пирогова, Россия) в дозах 1 ЭТД и 10 ЭТД не обладает аллергенностью в тестах гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах (реакция кожной анафилаксии), гиперчувствительности «немедленного» типа (реакция общей анафилаксии – анафилактический шок) и в тесте конъюнктивальная проба на кроликах. Был обнаружен единичный случай развития аллергической реакции по немедленному типу в виде слабого анафилактического шока без смертельного исхода и кожной анафилаксии в виде гиперемии и отека в месте инъекции, что позволяет заключить о возможной способности препарат VRF_11, порошок для приготовления раствора для внутривенного введения (ФГБОУ ВО РНИМУ им Н.И. Пирогова, Россия) к сенсибилизации организма и индивидуальной чувствительности.
  12. На основании фармакокинетических исследований по изменению содержания препарата VRF_11 в крови и таких органах, как печень, почки, кора головного мозга показано, что в интервале исследованных доз фармакокинетика препарата носит дозозависимый характер и удовлетворительно аппроксимируется в рамках одночастевой модели без всасывания. Препарат выводится как через почки, так и с участием фермантативных систем печени. Фармакокинетические исследования, проведенные на двух видах животных, показали совпадение фармакокинетических профилей.
  13. Выполнено материально-техническое обеспечение работ.

1 этап

В ходе выполнения проекта по теме «Доклинические исследования лекарственного средства, действующего на нейротрофины – BDNF и/или NGF с активацией MAP киназы, для лечения последствий ишемического инсульта)» по Соглашению о предоставлении субсидии от 22 ноября 2017 года №№ 14.N08.11.0181с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с 22 ноября по 6 декабря 2017 года выполнялись следующие работы:

  • Подготовлен аналитический обзор информационных источников
  • Проведено патентное исследование
  • Разработана лабораторная технология получения лекарственного средства (далее - ЛС).
  • Разработаны методики анализа качества опытных образцов ЛС
  • Произведена наработка опытных образцов ЛС
  • Проведен анализ качества опытных образцов лекарственного средства, закладка образцов на хранение для изучения стабильности.
  • Подготовлен промежуточный отчет ПНИЭР
  • Проведена предварительная (частичная) валидация методик контроля качества лекарственного средства.
  • Подготовлен отчет о материально-техническом обеспечении 

Полученные результаты соответствуют Техническому заданию проекта и позволяют продолжить работы.  

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчётном этапе исполненными надлежащим образом.